Рестрикционните ензими са ензими, които разрязват едновременно и двуверижна ДНК. Всеки рестрикционен ензим има специфична нуклеотидна последователност, наречена рестриктазен сайт, която разпознава и разрязва. Рестрикционните ензими се използват за ДНК секвениране, мутационен анализ и клониране и амплификация на ДНК. Учените използват рестрикционни ензими, за да вмъкнат гени от интерес в експресионни вектори, ДНК молекули, които могат да се реплицират отделно от хромозомната ДНК. След това векторът, съдържащ желания ген, може да бъде въведен в бактериален щам за експресия и характеризиране на протеини.
Етап 1
Идентифицирайте рестрикционните ензимни сайтове във вашия вектор, като потърсите ограничителна карта. Рестриктивната карта ще ви покаже кои ензими ще отрежат вашия вектор и къде.
Стъпка 2
Изберете рестрикционен ензим, който също има място, намиращо се във вашата генна вложка, като разгледате последователността на вмъкнатата. Уверете се, че мястото за ограничаване е в позицията на вмъкнатата част, която е извън интересното ген, така че да не загубите никаква част от гена.
Стъпка 3
Уверете се, че няма дубликати на мястото за ограничаване някъде в генния вмъкнат или вектор. Това ще доведе до множество съкращения в ДНК ви и ще ви даде подвеждащи данни.
Стъпка 4
Опитайте се да изберете рестрикционни ензими, които се отрязват с лепкави краища, а не с тъпи краища. Лепкави краища се появяват, когато ензимът разрязва двойно усукана ДНК по стръмен начин, оставяйки еднолентова прегръдка, която улеснява прикрепването с врязана вложка в обратна посока. Тънките краища се появяват, когато двойноверижната ДНК се изрязва гладко и те са по-трудни за прикрепване.
Стъпка 5
Изберете различен рестриктивен ензим и за двата края на вашата вложка, за да се уверите, че е вмъкнат във вектора в правилната ориентация и да се уверите, че векторът не се прикрепя отново към себе си.
Стъпка 6
Опитайте се да изберете два ограничаващи ензими, които функционират добре в една и съща буферна система и температура. Ако това не е възможно, изпълнете всяко разграждане отделно.
Нещата, от които се нуждаете
- Последователност на вмъкване на ген
- Карта за ограничение за избрания вектор
- Списък на рестрикционните ензими и техните места за нарязване
Съвети
- Някои уеб програми бяха разработени за бързо идентифициране на местата за ограничаване на ДНК последователността. Една такава програма е от New England BioLabs.
